플라스미드 DNA의 추출

플라스미드 DNA의 추출은 분자 생물학에서 기본적이고 중요한 실험 기술이며, 이는 박테리아와 같은 숙주 세포로부터 플라스미드 DNA를 분리하고 정제하는 과정을 포함한다. 플라스미드는 외래 유전자를 박테리아로 운반하기위한 주요 벡터이며, 유전자 공학, 유전자 요법, 백신 발달 및 기타 분야에 널리 사용된다. 다음은 플라스미드 DNA 추출에 대한 자세한 단계와 예방 조치입니다.

1. 플라스미드 DNA의 개요

플라스미드는 염색체 외부의 안정적인 유전자 인자입니다. 그것은 일반적으로 이중 가닥 폐쇄 루프 DNA 분자이며 슈퍼 헬릭스 상태의 숙주 세포에 존재합니다. 플라스미드 크기는 1 내지 200 kb이며, 주로 박테리아, 액 티노 마이 세트 및 곰팡이 세포에서 발견된다. 그것은 독립적으로 복제하고 전사 할 수 있으며, 자손 세포에서 일정한 카피 수를 유지하며, 그 유전자 정보를 발현하는 능력이 있습니다.

2. 플라스미드 DNA 추출을위한 기본 단계

박테리아로부터 플라스미드 DNA를 분리하는 방법은 일반적으로 세 가지 기본 단계를 포함한다. 박테리아를 배양하여 플라스미드를 증폭시키고, 세포를 수집하고 누워 있고, 플라스미드 DNA를 분리하고 정제한다. 다음은 플라스미드 DNA의 추출 과정을 자세히 도입하기 위해 알칼리 절단을 예로 사용합니다.

1. 박테리아를 배양하여 플라스미드를 증폭시킵니다

1> 적합한 박테리아 균주 (예 : e.coli dh5α) 및 플라스미드 벡터 (예 : PUC19)를 선택하십시오.

2> 적절한 항생제 (예 : 암피실린)를 함유 한 LB 액체 배지에서 박테리아를 접종하고, 37 ℃ (약 12-14 시간)에서 밤새 배양하여 플라스미드가 박테리아에서 증폭 될 수 있도록한다.

2. 세포를 수집하고 수집하십시오

1> 일정량의 박테리아 용액을 가져 가서 원심 분리하여 상청액을 제거하고 박테리아 침전을 수집하십시오.

2> 알칼리 용해 방법을 사용하여 박테리아 세포를 해독하십시오. 일반적으로 사용되는 시약은 용액 I (포도당, TRIS-HCL 및 EDTA를 함유하는 세포막 완전성을 유지하는 데 사용됨), 용액 II (세포막 및 DNA를 파괴하는 데 사용되는 NaOH 및 SDS 포함) 및 용액 III (KAC 및 빙하 아세트산을 함유하는 데 사용되는), NaOH 및 크로코 좀 DNA를 중화시키는 데 사용되는 용액 III ()를 포함한다.

3> 박테리아 세포는 용해되고 플라스미드 DNA는 일련의 온화한 수술 (예 : 부드러운 플립, 얼음 배치 등)을 통해 방출됩니다.

3. 플라스미드 DNA를 분리하고 정제합니다

1> 원심 분리하여 세포 파편 및 염색체 DNA 침전을 제거하고, 플라스미드 DNA를 함유하는 상청액을 수집합니다.

2> 페놀 클로로포름-이소 아밀 알코올 혼합물 및 기타 시약을 사용하여 플라스미드 DNA를 추가로 정제하여 단백질 및 다른 불순물을 제거합니다.

3> 무수 에탄올 또는 이소프로판올 침전에 의해 플라스미드 DNA를 회수하고이를 적절한 완충제 (예 : TE 완충액)에 용해시킨다.

3. 주목할만한 것들

1. 작동 사양 : 전체 추출 과정에서 외인성 DNA의 오염을 피하기 위해 멸균 수술 사양을 엄격하게 따라야합니다.

2. 시약 선택 : 실험의 정확성과 반복성을 보장하기 위해 고품질 시약 및 소모품을 선택하십시오.

3. 조건 제어 : 최상의 추출 효과를 얻기 위해 실험 조건 (예 : 온도, 시간, pH 등) 제어에주의를 기울입니다.

4. 안전 보호 : 독성 또는 유해한 시약을 사용할 때 개인 보호 및 실험실 안전 조치를 취해야합니다.

4. 요약

플라스미드 DNA의 추출은 분자 생물학에서 중요한 실험 기술이다. 이 과정에는 박테리아 배양, 세포 용해 및 DNA 정제와 같은 여러 단계가 포함됩니다. 엄격한 작동 사양 및 조건부 제어를 통해 고급 및 고품질 플라스미드 DNA를 얻을 수있어 후속 실험 연구를 강력하게 지원합니다.