应用笔记 | 告别复杂设备！自动化移液剪切技术助力PacBio长读长测序效率提升

DNA测序作为生命科学研究的核心工具，其数据质量高度依赖于精准的DNA片段化处理。传统方法常需依赖高成本的专用设备且操作流程复杂。本应用笔记详细阐述了如何利用 Opentrons Flex 自动化移液工作站实现移液剪切技术的自动化操作，以满足 PacBio 测序对 DNA 片段的特定需求。

Opentrons Flex 自动化移液工作站

本应用笔记系统阐述了通过移液剪切技术实现高分子量（HMW）DNA定向片段化的标准化流程，所生成的DNA片段符合PacBio®长读长文库制备的尺寸要求。该方法对起始材料具有广泛兼容性，可基于完整HMW DNA或部分降解DNA样本实现稳定、可重复的片段化效果。

1 实验方法

样本制备:
使用 Nanobind HMW DNA 提取试剂盒（PacBio，产品编号：103-   260-000）从血液中分离出高分子量 DNA。从 NA12878 细胞系中提 取降解的 DNA 作为另一组起始材料。
DNA 片段化：
采用 Opentrons Flex 自动化移液工作站执行移液剪切操作。将 DNA稀释于 LTE 缓冲液（PacBio，产品编号：103-228-900）中，并置于 Nest 2 mL 深孔板内（Opentrons，产品编号：999-00103）。根据表 1 所示条件进行剪切操作。

表 1. 移液剪切条件

实验数据展示

采用 Femto Pulse（Agilent，产品编号：M5330AA）仪器，并配套使用 gDNA 165kb 分析试剂盒（Agilent，产品编号：  FP-1002-0275） ，对剪切前后的 DNA 样本进行了毛细管脉冲场电泳分析。
在本次研究中，对 3μg 和 5μg 的高分子量 DNA（HMW DNA）样本进行了移液剪切处理，并详细分析了剪切前后 DNA 片段的长度变化。3μg 和 5μg 的 DNA 样本分别在 300μL 和 500μL 的 LTE 缓冲液中稀释。
在评估 DNA 剪切质量的过程中，重点关注基因组质量数值 (GQN)，该指标表明 DNA 的完整性，以及符合 PacBio 长读长 DNA 片段的特定尺寸和分布要求。这些要求包括：
• 平均片段大小需位于 15-20kb 之间
• 分布范围应在 10-30kb 之间
• 剪切片段的大致范围为 5-40kb

本研究中使用的完整 HMW DNA 样本在 30 kb 阈值下的 GQN 分别为 8（3 µg 样本）和 8.8（5 µg 样本）。剪切后的 DNA 符合上述所有要求，表明移液剪切技术可以提供适合 PacBio 测序的 DNA 片段（图 1）。

(A）3 µg HMW DNA，剪切前后对比

(B）5 µg HMW DNA，剪切前后对比

图 1. 剪切前后高分子量（HMW）DNA 的情况

(A) 剪切前（黑色）和剪切后（蓝色）的 3 µg 高分子量 DNA。剪切后的 DNA 平均片段大小为 18,337 bp。
(B) 剪切前（黑色）和剪切后（蓝色）的 5 µg 高分子量 DNA。剪切后的 DNA 平均片段大小为 17,665 bp。

考虑到 DNA 样本往往源自质量不佳的材料，这些材料中的 DNA 在剪切处理前可能已经发生了一定程度的降解。例如，来自福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织的 DNA 就常常面临这样的问题。
为确认移液剪切是否适用于这些情况，我们分析了降解 DNA 的表现，分别使用 3 µg 和 5 µg 样本，且两者在 30 kb 阈值下的 GQN（基因组质量数值）为 4.5。这些样本的剪切结果同样满足文库构建所需的片段大小质量控制要求（图 2）。

A）3μg 降解 DNA，剪切前后对比

B）5μg 降解 DNA，剪切前后对比

图 2. 剪切前后的降解基因组 DNA
(A) 剪切前（黑色）和剪切后（蓝色）的 3 µg 降解 DNA。剪切后的 DNA 平均片段大小为 15,751 bp。
(B) 剪切前（黑色）和剪切后（蓝色）的 5 µg 降解 DNA。剪切后的 DNA 平均片段大小为 15,916 bp。

图2.转录本和基因检测敏感度。
A)每个细胞中检测到的转录本:显示在不同测序深度下，PBMC(外周血单核细胞)中每个细胞检测到的转录本的中位数。
B)每个细胞中检测到的基因:显示在不同测序深度下，PBMC 中每个细胞检测到的基因的中位数。

结论

研究数据表明，基于Opentrons Flex 自动化移液工作站的自动化DNA移液剪切技术不仅能够适配完整的高分子量（HMW）DNA样本，同时对已发生降解的DNA样本（如FFPE来源样本）亦展现出稳定处理能力。经剪切后的DNA片段在平均大小（15-20 kb）及分布范围（10-30 kb）上均符合 PacBio® 长读长测序的文库构建标准。基于此，自动化移液剪切技术可作为传统机械剪切方法（如超声、雾化等）的可靠替代方案，为PacBio测序的文库制备提供标准化、可扩展的高效路径。