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应用笔记 | 在 Opentrons Flex 上自动化运行 PacBio HiFi 测序的文库制备

长读长测序技术对于组装全基因组的科学家来说是一项颠覆性技术。PacBio 的 HiFi 测序是一种长读长测序方法，它能提供类似短读长的准确性，但读长可达数千碱基。在 Opentrons Flex 移液工作站上为 HiFi 测序制备样本涉及两个环节：

(1) 通过其短读长去除（SRE）试剂盒消除短 DNA 并对剩余的 DNA 进行机械片段化；

(2) 构建用于 HiFi 测序的 DNA 文库。

在本应用笔记中，我们演示了如何在 Opentrons Flex 上自动化这一流程，从而以更少的用户人为干预和手动操作时间生产高质量的文库。

主要亮点

在8小时内自动化完成 SRE、DNA 剪切和文库制备，手动操作时间仅需1小时。

自动化文库制备可提供与手动方法相似的高质量结果，满足 PacBio 在产量、条形码（barcode）和碱基质量方面的基准。

一

实验方法

应用笔记 | 在 Opentrons Flex 上自动化运行 PacBio HiFi 测序的文库制备配图2

图 1. 短读长去除和 DNA 片段化方案（上图）以及 HIFI 文库制备方案（下图）的工作流程步骤。

工作流程每个阶段下方显示了手动步骤（浅蓝色）和 Opentrons Flex 上的自动化步骤（深蓝色）。

样本制备

高分子量（HMW）DNA 来源于 Coriel 医学研究所，以及使用PacBio Nanobind PanDNA kit 从人类唾液和全血中提取。

短读长去除（SRE）和 DNA 片段化

我们使用 PacBio SRE HT kit 去除短读长，并在 Opentrons Flex 自动化移液工作站上使用 PacBio 短读长去除和移液器剪切方案，通过移液器剪切将高分子量 DNA 片段化至 15-20 kb。

片段化 DNA 分析

使用 Agilent Femto Pulse 系统和 Genomic DNA 165 kb kit 对剪切前和剪切后的 DNA 进行分析。

全基因组测序 HIFI 文库制备

使用片段化 DNA(≤ 3 µg），通过 PacBio HIFI prep kit 96 和 Revio SPRQ polymerase kit 96 生成可用于测序的HIFI文库。该方案在 Opentrons Flex NGS 工作站上使用 PacBio 全基因组测序 HIFI 文库制备方案实现了自动化。

HIFI 测序

使用 PacBio Revio 系统对 HIFI 文库进行测序，每个 SMRT® Cell 上样一个文库复合物。使用 Revio SPRQ sequencing plate and polymerase kit，测序运行约 24 小时。文库以 250 pM的浓度采用适应性上样方式进行上样。

HiFi 测序文库分析

使用 Qubit™ IX dsDNA High Sensitivity Assay Kit 和 Qubit 4 荧光计对 DNA 进行定量，以评估输入 DNA 质量、HiFi 文库质量以及退火、结合和纯化步骤后的文库复合物质量。使用 SMRT® Link 分析软件处理原始测序数据，以生成质量控制报告并确定检测到的条形码读长百分比、条形码/样本交叉污染以及碱基质量。

二

实验结果

短读长去除和 DNA 剪切

为了制备用于 PacBio HiFi 文库制备和测序的高分子量 DNA，我们使用 PacBio 短读长去除和移液器剪切工作流程在 Opentrons Flex 上自动化运行。该方案首先逐步去除高达 25 kb 的片段，这提高了样本质量，特别是在样本部分降解的情况下。短片段去除后，高分子量 DNA 随后通过移液器剪切至 15-20 kb，并使用 SMRTbell 磁珠进行纯化。我们使用 Agilent Femto Pulse 系统分析了这些片段。图 2A 显示了输入 DNA，图 2B 显示了短读长去除后的输出。图 2C 显示了移液器剪切后的大小分布。如图所示，经过此工作流程后的 DNA 大小约为 15 kb（平均 15,472 bp，峰值在 14,739 bp），这是 PacBio HiFi 文库制备所需的理想输入大小。

应用笔记 | 在 Opentrons Flex 上自动化运行 PacBio HiFi 测序的文库制备配图3

图2.短读长去除和移液器剪切过程中高分子量片段大小的分析。

(A)工作流程开始前的输入高分子量 DNA。

(B)短读长去除后的高分子量 DNA。

(C)剪切和 1X SMRTbell 磁珠纯化后的高分子量 DNA。

在 Opentrons Flex 上自动化此过程的一个优点是无需购买专门的 DNA 剪切设备。并且，我们证明了能够使用移液器剪切生成片段化 DNA，从而简化流程并降低成本。总的来说，我们能够在 3.5 小时内完成5个样本的 SRE 和剪切。

全基因组测序 HiFi 文库制备

工作流程的下一步是使用 PacBio 全基因组测序 HiFi 文库制备工作流程制备 HiFi DNA 文库。分析文库制备成功与否的关键指标需要比较制备文库后回收的 DNA 量（文库质量）、加载聚合酶后（ABC 复合质量）与输入 DNA 的量。我们发现总回收率（即加载聚合酶后剩余的输入 DNA 百分比）符合预期的 10-25% 回收率范围（表 1）。

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表 1. 全基因组测序 HIFI 文库制备方案后的 DNA 质量和回收百分比。

输入质量代表片段化后的 DNA 质量。文库质量是制备文库后、与聚合酶复合前回收的 DNA 量。ABC（退火、结合、纯化）质量是最终纯化后与聚合酶复合的 DNA 量。总回收率 % = (ABC 复合质量) / (输入质量) × 100。

制备文库后，下一步是对文库进行测序并评估质量控制指标。为此，我们首先查看了条形码。每个样本都被分配一个唯一的条形码，以便识别样本。我们发现，在我们的五个重复样本中，每个样本都只包含一种条形码，表明样本之间没有交叉污染（表2）。平均而言，93.4% 的读长包含条形码。

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表 2. HIFI 测序指标

接下来，我们转向测序指标，如 HIFI 产量、Q30 质量分数和读长，以评估文库的测序效果。产量是指测序的碱基数量，理想情况下应在 100 Gb 到 120 Gb 之间。我们发现我们的数据基本符合这种情况，因为我们的重复样本产量范围在 98.33 Gb 到 115.29 Gb 之间。我们的数据显示读长 N50 为 15.9 kb，在推荐的最佳全基因组测序结果的 15-20 kb 大小范围内。对于我们的重复样本，我们发现 93-95% 的碱基高于 Q30，符合 PacBio 的 ≥90% Q30 的成功标准。

结论

我们发现，自动化 PacBio HiFi 测序的全基因组测序文库制备可产生高质量的文库和测序结果。这些工作流程的 Opentrons 方案可在 8 小时内完成，且手动操作时间仅需 1 小时。

特别鸣谢

感谢 Psomagen 公司的 Cristian Bravo、Alice Jung 和 Elly Lee 对方法开发提供的宝贵反馈。

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